Био-МЭМС

Примером био-МЭМС устройства является этот автоматизированный микрочип FISH, который объединяет мультиплексор реагентов, клеточную камеру с тонкопленочным нагревательным слоем и перистальтический насос.

Био-МЭМС (англ. Bio-MEMS) — это аббревиатура для биомедицинских (или биологических) микроэлектромеханических систем. Био-МЭМС значительно пересекаются и иногда считаются синонимами лабораторий-на-чипе (LOC) и систем микрототального анализа (μTAS). Био-МЭМС, как правило, больше сосредоточены на механических деталях и технологиях микрофабрикации, пригодных для биологических приложений. С другой стороны, лаборатория-на-чипе занимается миниатюризацией и интеграцией лабораторных процессов и экспериментов в отдельные (часто микрофлюидные) чипы. В этом определении устройства lab-on-a-chip не имеют строго биологического применения, хотя большинство из них имеют или могут быть адаптированы для биологических целей. Аналогично, системы микрототального анализа могут не иметь биологического применения и обычно предназначены для химического анализа. Широкое определение био-МЭМС может быть использовано для обозначения науки и технологии работы на микромасштабе для биологических и биомедицинских применений, которые могут включать или не включать какие-либо электронные или механические функции. Междисциплинарный характер био-МЭМС объединяет материаловедение, клинические науки, медицину, хирургию, электротехнику, машиностроение, оптическую инженерию, химическую инженерию и биомедицинскую инженерию. Некоторые из основных областей применения био-МЭМС включают геномику, протеомику, молекулярную диагностику, диагностику в местах оказания медицинской помощи, тканевую инженерию, анализ отдельных клеток и имплантируемые микроустройства.

История

В 1967 году С. Б. Картер сообщил об использовании теневых палладиевых островков для прикрепления клеток. После этого первого исследования био-МЭМС последующее развитие в этой области было медленным в течение примерно 20 лет. В 1985 году компания Unipath Inc. выпустила на рынок ClearBlue, тест на беременность, который используется и сегодня, который можно считать первым микрофлюидным устройством, содержащим бумагу, и первым микрофлюидным продуктом на рынке. В 1990 году Андреас Манц и Х. Майкл Видмер из швейцарской компании Ciba-Geigy (ныне Novartis) впервые использовали термин «микросистема полного анализа» (μTAS) в своей основополагающей статье, в которой предложили использовать миниатюрные системы полного химического анализа для химического зондирования. Концепция μTAS была мотивирована тремя основными факторами. Во-первых, открытие лекарств в последние десятилетия, вплоть до 1990-х годов, было ограничено из-за времени и стоимости параллельного проведения множества хроматографических анализов на макроскопическом оборудовании. Во-вторых, проект «Геном человека» (HGP), начавшийся в октябре 1990 года, вызвал потребность в улучшении возможностей секвенирования ДНК. Таким образом, капиллярный электрофорез стал основным средством разделения химических веществ и ДНК. В-третьих, DARPA Министерства обороны США в 1990-х годах поддержало ряд исследовательских программ в области микрофлюидики, осознав необходимость разработки развертываемых в полевых условиях микросистем для обнаружения химических и биологических агентов, представляющих потенциальную военную и террористическую угрозу. Исследователи начали использовать оборудование фотолитографии для микрофабрикации микроэлектромеханических систем (МЭМС), унаследованное от микроэлектронной промышленности. В то время применение МЭМС в биологии было ограничено, поскольку эта технология была оптимизирована для кремниевых или стеклянных пластин и использовала фоторезисты на основе растворителей, которые были несовместимы с биологическим материалом. В 1993 году Джордж М. Уайтсайдс, химик из Гарварда, представил недорогую микрофабрику на основе ПДМС, что произвело революцию в области био-МЭМС. С тех пор область био-МЭМС переживает бурный рост. Среди основных технических достижений в области био-МЭМС в 1990-х годах можно выделить следующие:

• В 1991 году был разработан первый олигонуклеотидный чип.
• В 1998 году были разработаны первые твердые микроиглы для доставки лекарств.
• В 1998 году был разработан первый чип для полимеразной цепной реакции с непрерывным потоком.
• В 1999 году впервые продемонстрированы гетерогенные ламинарные потоки для селективной обработки клеток в микроканалах.

Сегодня гидрогели, такие как агароза, биосовместимые фоторезисты и самосборка являются ключевыми областями исследований в улучшении био-МЭМС в качестве замены или дополнения PDMS.

Подходы

Материалы

Кремний и стекло

Традиционные методы микрообработки, такие как мокрое травление, сухое травление, глубокое реактивное ионное травление, напыление, анодное соединение и соединение плавлением, используются в био-МЭМС для изготовления проточных каналов, датчиков потока, химических детекторов, разделительных капилляров, смесителей, фильтров, насосов и клапанов. Однако использование устройств на основе кремния в биомедицинских приложениях имеет некоторые недостатки, такие как высокая стоимость и биологическая несовместимость. Из-за одноразового использования, больших размеров по сравнению с МЭМС-аналогами и требования к чистоте помещений, высокая стоимость материалов и обработки делает био-МЭМС на основе кремния менее экономически привлекательными. В естественных условиях био-МЭМС на основе кремния могут быть легко функционализированы для минимизации адсорбции белков, но хрупкость кремния остается основной проблемой.

Пластмассы и полимеры

Использование пластмасс и полимеров в био-МЭМС привлекательно тем, что они легко изготавливаются, совместимы с методами микрообработки и быстрого прототипирования, а также имеют низкую стоимость. Многие полимеры также оптически прозрачны и могут быть интегрированы в системы, использующие оптические методы обнаружения, такие как флуоресценция, УФ/Вид поглощение или метод Рамана. Более того, многие полимеры биологически совместимы, химически инертны к растворителям и электрически изолированы для приложений, где необходимы сильные электрические поля, например, для электрофоретического разделения. Химический состав поверхности полимеров также может быть изменен для конкретных применений. В частности, поверхность ПДМС может быть облучена ионами таких элементов, как магний, тантал и железо, для снижения гидрофобности поверхности, что позволяет улучшить адгезию клеток в условиях «in vivo». Наиболее распространённые полимеры, используемые в био-МЭМС, включают ПММА, ПДМС, OSTEmer и SU-8.

Биологические материалы

• A) Микронанесение фибронектина на поверхность стекла PNIPAM.
• B) и C) Одиночные фибробласты пространственно ограничены геометрией микрошаблона фибронектина.
• Микромасштабное манипулирование и нанесение рисунка на биологические материалы, такие как белки, клетки и ткани, используется при разработке клеточных массивов, микромассивов, тканевой инженерии на основе микрофабрик и искусственных органов. * Биологический микропаттернинг может быть использован для высокопроизводительного анализа отдельных клеток, точного контроля клеточного микроокружения, а также контролируемой интеграции клеток в соответствующие многоклеточные архитектуры для воспроизведения условий in vivo. Фотолитография, микроконтактная печать, селективная микрофлюидная доставка и самособирающиеся монослои — вот некоторые методы, используемые для нанесения биологических молекул на поверхности. Для нанесения микрошаблонов на клетки можно использовать микроконтактное нанесение белков внеклеточного матрикса, клеточный электрофорез, оптические пинцетные решетки, диэлектрофорез и электрохимически активные поверхности.

Бумага

Бумажная микрофлюидика (иногда называемая «лаборатория на бумаге») — это использование бумажных подложек в микрофабриках для манипулирования потоками жидкости в различных приложениях. Бумажная микрофлюидика применяется в бумажном электрофорезе и иммуноанализе, наиболее известным из которых является коммерциализированный тест на беременность ClearBlue. Преимущества использования бумаги для микрофлюидики и электрофореза в био-МЭМС включают ее низкую стоимость, биоразлагаемость и естественное фитильное действие. Серьезным недостатком микрофлюидики на основе бумаги является зависимость скорости фитиля от условий окружающей среды, таких как температура и относительная влажность. Бумажные аналитические устройства особенно привлекательны для диагностики в развивающихся странах как из-за низкой стоимости материала, так и из-за акцента на колориметрические анализы, которые позволяют медицинским работникам легко интерпретировать результаты на глаз. По сравнению с традиционными микрофлюидическими каналами, бумажные микроканалы доступны для ввода образцов (особенно образцов судебно-медицинского характера, таких как биологические жидкости и почва), а также благодаря своим естественным фильтрующим свойствам, исключающим попадание в образцы остатков клеток, грязи и других примесей. Реплики на бумажной основе продемонстрировали такую же эффективность при выполнении обычных микрофлюидных операций, таких как гидродинамическая фокусировка, выделение молекул по размеру, микросмешивание и разбавление; обычные 96- и 384-луночные микропланшеты для автоматизированной обработки и анализа жидкостей были воспроизведены с помощью фотолитографии на бумаге для достижения более тонкого профиля и снижения стоимости материала при сохранении совместимости с обычными устройствами для чтения микропланшетов. Методы нанесения микрошаблонов на бумагу включают фотолитографию, лазерную резку, струйную печать, плазменную обработку и нанесение рисунка на воск.

Электрокинетика

Пример эксперимента по электрофорезу: Два конических электрода устанавливаются на входе и выходе микроканала, и клетки перемещаются вдоль микроканала под действием постоянного электрического поля. Электрокинетика была использована в био-МЭМС для разделения смесей молекул и клеток с помощью электрических полей. При электрофорезе заряженный вид в жидкости перемещается под воздействием приложенного электрического поля. Электрофорез использовался для фракционирования малых ионов, заряженных органических молекул, белков и ДНК. Электрофорез и микрофлюидика являются синергетическими, поскольку в микроканалах можно использовать более высокие напряжения благодаря более быстрому отводу тепла. Изоэлектрическая фокусировка — это разделение белков, органелл и клеток с различными изоэлектрическими точками. Для изоэлектрической фокусировки необходим градиент pH (обычно создаваемый с помощью электродов), перпендикулярный направлению потока. Сортировка и фокусировка интересующих видов достигается благодаря тому, что электрофоретическая сила вызывает перпендикулярную миграцию до тех пор, пока они не потекут вдоль соответствующих изоэлектрических точек. Диэлектрофорез — это движение незаряженных частиц вследствие индуцированной поляризации под действием неоднородных электрических полей. Диэлектрофорез может быть использован в био-МЭМС для создания диэлектрофоретических ловушек, концентрации определенных частиц в определенных точках на поверхности и перенаправления частиц из одного потока в другой для динамической концентрации.

Био-МЭМС для диагностики

Геномные и протеомные микрочипы

Affymetrix GeneChip® является примером геномного микрочипа. Цели геномных и протеомных микрочипов — сделать высокопроизводительный анализ генома быстрее и дешевле, а также выявить активированные гены и их последовательности. Существует множество различных типов биологических объектов, используемых в микрочипах, но в целом микрочип состоит из упорядоченной коллекции микроточек, каждая из которых содержит один определённый молекулярный вид, взаимодействующий с аналитом, для одновременного тестирования тысяч параметров в одном эксперименте. Некоторые области применения геномных и протеомных микрочипов — неонатальный скрининг, определение риска заболеваний и прогнозирование эффективности терапии для персонализированной медицины.

Олигонуклеотидные чипы

Олигонуклеотидные чипы — это микрочипы олигонуклеотидов. Они могут использоваться для обнаружения мутаций и мониторинга экспрессии, а также для обнаружения и картирования генов. Основными методами создания олигонуклеотидных микрочипов являются гелевые подушечки (Motorola), микроэлектроды (Nanogen), фотолитография (Affymetrix) и струйная технология (Agilent).

С помощью гелевых подушечек готовые олигонуклеотиды прикрепляются к участкам активированного полиакриламида. С помощью микроэлектродов отрицательно заряженные ДНК и молекулярные зонды могут быть сконцентрированы на заряженных электродах для взаимодействия. С помощью фотолитографии на подложке создается световое воздействие с использованием фотомаски или виртуальной фотомаски, проецируемой с цифрового микрозеркального устройства. Свет удаляет фотолиабильные защитные группы из выбранных областей воздействия. После снятия защиты нуклеотиды с фотолабильной защитной группой подвергаются воздействию света по всей поверхности, и процесс химического соединения происходит только там, где на предыдущем этапе было воздействие света. Этот процесс может быть повторен для синтеза олигонуклеотидов относительно небольшой длины на поверхности, нуклеотид за нуклеотидом. Используя струйную технологию, нуклеотиды наносятся на поверхность капля за каплей, образуя олигонуклеотиды

Микрочипы кДНК

Микрочипы кДНК часто используются для крупномасштабного скрининга и изучения экспрессии. В кДНК-микрочипах мРНК из клеток собирают и преобразуют в кДНК путем обратной транскрипции. Затем молекулы кДНК (каждая из которых соответствует одному гену) иммобилизуются в виде пятен диаметром ~100 мкм на мембране, стекле или кремниевом чипе с помощью металлических штифтов. Для детекции флуоресцентно меченные одноцепочечные кДНК из клеток гибридизуются с молекулами на микрочипе, и для анализа используется дифференциальное сравнение между обработанным (например, помеченным красным цветом) и необработанным образцом (помеченным другим цветом, например, зелёным). Красные точки означают, что соответствующий ген был экспрессирован на более высоком уровне в обработанном образце. И наоборот, зелёные точки означают, что соответствующий ген был экспрессирован на более высоком уровне в необработанном образце. Жёлтые точки, как результат перекрытия красных и зелёных точек, означают, что соответствующий ген экспрессировался на относительно одинаковом уровне в обоих образцах, тогда как темные точки указывают на отсутствие или незначительную экспрессию в обоих образцах.

Пептидные и белковые микрочипы

Мотивация для использования пептидных и белковых микрочипов заключается, во-первых, в том, что транскрипты мРНК часто плохо коррелируют с фактическим количеством синтезированного белка. Во-вторых, ДНК-микрочипы не могут определить посттрансляционную модификацию белков, которая непосредственно влияет на функцию белка. В-третьих, в некоторых биологических жидкостях, таких как моча, отсутствуют мРНК. Белковый микрочип состоит из библиотеки белков, иммобилизованной на подложке, обычно стеклянной, кремниевой, полистироловой, PVDF или нитроцеллюлозной. В целом, существует три типа белковых микрочипов: функциональные, аналитические или захватные и обращённо-фазовые белковые массивы.

Функциональные белковые массивы отображают свёрнутые и активные белки и используются для скрининга молекулярных взаимодействий, изучения белковых путей, выявления мишеней для посттрансляционной модификации и анализа ферментативной активности. Аналитические или захватные белковые массивы отображают антигены и антитела для профилирования экспрессии белка или антитела в сыворотке. Эти массивы могут использоваться для обнаружения биомаркеров, мониторинга количества белков, мониторинга состояния активности в сигнальных путях и профилирования репертуара антител при заболеваниях. Обратно-фазовые белковые массивы тестируют реплики клеточных лизатов и образцов сыворотки с различными антителами для изучения изменений в экспрессии конкретных белков и модификаций белков во время развития болезни, а также для обнаружения биомаркеров. Белковые микрочипы имеют строгие условия производства, хранения и проведения экспериментов из-за низкой стабильности и необходимости учитывать нативную складчатость иммобилизованных белков. Пептиды, с другой стороны, более химически устойчивы и могут сохранять частичные аспекты функции белка. Поэтому пептидные микрочипы используются в дополнение к белковым микрочипам в протеомных исследованиях и диагностике. Белковые микрочипы обычно используют кишечную палочку для получения интересующих белков, в то время как пептидные микрочипы используют технику SPOT (поэтапный синтез пептидов на целлюлозе) или фотолитографию для получения пептидов.

ПЦР-чипы

Микрофлюидная система ПЦР на основе непрерывного потока с тонкопленочными нагревателями, шприцевым насосом и каналом ПЦР непрерывного потока. Данный пример био-МЭМС применяется для амплификации РНК гриппа А в респираторных образцах. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это фундаментальный метод молекулярной биологии, позволяющий селективно амплифицировать последовательности ДНК, что полезно для расширенного использования редких образцов, например: стволовых клеток, биопсий, циркулирующих опухолевых клеток. Реакция включает в себя термоциклирование последовательности ДНК и ДНК-полимеразы при трех различных температурах. Нагревание и охлаждение в обычных устройствах ПЦР занимает много времени, и типичные реакции ПЦР могут длиться часами. Другими недостатками традиционной ПЦР являются высокий расход дорогостоящих реагентов, предпочтение амплификации коротких фрагментов и получение коротких химерных молекул. ПЦР-чипы служат для миниатюризации реакционной среды для достижения быстрой теплопередачи и быстрого смешивания благодаря большему отношению поверхности к объему и коротким расстояниям диффузии. Преимущества чипов ПЦР включают в себя более короткое время термоциклирования, более равномерную температуру, что повышает выход продукции, и портативность для применения в медицинских учреждениях. Две проблемы микрофлюидических ПЦР-чипов — ингибирование ПЦР и загрязнение из-за большого отношения поверхности к объему, увеличивающего взаимодействие поверхности и реагента. Например, кремниевые подложки обладают хорошей теплопроводностью для быстрого нагрева и охлаждения, но могут отравлять полимеразную реакцию. Кремниевые подложки также непрозрачны, что препятствует оптическому обнаружению для qPCR, и электропроводны, что препятствует электрофоретическому переносу по каналам. Между тем, стекло является идеальным материалом для электрофореза, но также препятствует реакции. Полимеры, в частности PDMS, оптически прозрачны, не препятствуют реакции и могут быть использованы для покрытия электрофоретического стеклянного канала. Существуют и другие виды обработки поверхности, включая полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин и диоксид кремния. Существуют стационарные (камерные), динамические (на основе непрерывного потока) и микрокапельные (цифровая ПЦР) архитектуры чипов.

Камерная архитектура является результатом уменьшения размеров обычных реакторов ПЦР, которые трудно масштабировать. С помощью этой архитектуры было разработано четырехслойное устройство из стекла-PDMS, включающее микроклапаны, микронагреватели, датчики температуры, реакционные камеры объёмом 380 нл и каналы капиллярного электрофореза для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) с аттомолярной чувствительностью обнаружения. Архитектура на основе непрерывного потока перемещает образец через различные температурные зоны для достижения термоциклирования. Этот подход потребляет меньше энергии и обладает высокой пропускной способностью, но имеет большой расход реагентов, а внутри проточных каналов могут образовываться пузырьки газа. Цифровая ПЦР исключает адсорбцию и загрязнение поверхности образца/реагента за счёт проведения ПЦР в микрокапельках или микрокамерах. ПЦР в капельках также предотвращает рекомбинацию гомологичных фрагментов генов, что исключает синтез коротких химерных продуктов.

Диагностические приборы для точечной диагностики

Акушерка берет кровь для измерения количества CD4 у пациентов в течение 20 минут с помощью анализатора CD4 Pima point-of-care в Уганде. Возможность проводить медицинскую диагностику у постели больного или в пункте оказания медицинской помощи имеет важное значение в здравоохранении, особенно в развивающихся странах, где доступ к централизованным больницам ограничен и непомерно дорог. С этой целью были разработаны био-МЭМС для диагностики в пунктах медицинской помощи, позволяющие брать образцы слюны, крови или мочи и в рамках комплексного подхода проводить предварительную подготовку образца, фракционирование образца, усиление сигнала, обнаружение аналитов, анализ данных и отображение результатов. В частности, кровь является очень распространенным биологическим образцом, поскольку она циркулирует в организме каждые несколько минут, и её содержимое может указывать на многие аспекты здоровья.

Кондиционирование проб

При анализе крови необходимо отделить лейкоциты, тромбоциты, бактерии и плазму. Сита, водосливы, инерционное удержание и устройства отвода потока — вот некоторые подходы, используемые для подготовки плазмы крови к бесклеточному анализу. Сита могут быть изготовлены из микрофабрики с колоннами или стойками с высоким аспектным отношением, но они подходят только для низкой загрузки, чтобы избежать засорения клетками. Водосливы — это неглубокие меза-подобные секции, используемые для ограничения потока узкими щелями между слоями без столбиков. Одним из преимуществ использования водосливов является то, что отсутствие столбиков позволяет более эффективно рециркулировать ретентат для потока через фильтр, чтобы смыть забитые клетки. Магнитные бусины используются для разделения аналитов. Эти микроскопические бусины функционализируются целевыми молекулами и перемещаются по микрофлюидическим каналам с помощью изменяющегося магнитного поля. Это служит быстрым методом сбора целевых молекул для анализа. После завершения этого процесса прикладывается сильное стационарное магнитное поле для иммобилизации связанных с мишенью бусин и вымывания несвязанных бусин. H-фильтр представляет собой микрофлюидное устройство с двумя входами и двумя выходами, которое использует преимущества ламинарного потока и диффузии для разделения компонентов, диффундирующих через границу раздела двух входных потоков. Контролируя скорость потока, расстояние диффузии и время пребывания жидкости в фильтре, клетки исключаются из фильтрата в силу их более медленной скорости диффузии. H-фильтр не засоряется и может работать бесконечно долго, но аналиты разбавляются в два раза. Для клеточного анализа клетки можно исследовать в интактном состоянии или после лизиса. Поток литического буфера может быть введён рядом с потоком, содержащим клетки, и путём диффузии вызывает лизис перед дальнейшим анализом. Анализ клеток обычно проводится с помощью проточной цитометрии и может быть реализован в микрофлюидике с меньшей скоростью потока и меньшей пропускной способностью, чем в обычных макроскопических аналогах.

Фракционирование образцов

Микрофлюидическое разделение образцов может быть достигнуто с помощью капиллярного электрофореза или разделения в непрерывном потоке. При капиллярном электрофорезе длинная тонкая трубка разделяет аналиты по напряжению по мере их миграции под действием электроосмотического потока. Для разделения непрерывным потоком общая идея заключается в приложении поля под углом к направлению потока, чтобы отклонить путь потока образца к различным каналам. Примеры методов разделения с непрерывным потоком включают электрофорез с непрерывным потоком, изоэлектрическое фокусирование, магнитное разделение с непрерывным потоком и молекулярное просеивание.

Выдающиеся проблемы

Большинство диагностических приборов, представленных на рынке, могут тестировать только на одно заболевание. Более того, большинство приборов имеют двоичный вывод (да/нет) без нюансов информации о состоянии пациента. Таким образом, помимо разработки тестов на большее количество заболеваний, ученые в настоящее время работают над повышением сложности этих устройств, чтобы увеличить их полезность. Производство МЭМС-диагностических устройств вне лабораторных условий затруднено. Большая часть исследований этих устройств проводится в лабораториях с регулируемым климатом, где устройства могут быть протестированы сразу после их производства. Однако, поскольку многие из этих устройств используются для скрининга на тропические заболевания, они должны быть достаточно прочными, чтобы выжить в жарких и влажных условиях. Они также должны храниться в течение длительного времени с момента производства до момента использования. Финансирование исследований тропических болезней ограничено. Кроме того, существует множество нормативных препятствий, которые необходимо преодолеть, прежде чем медицинское устройство будет одобрено, что может стоить десятки миллионов долларов. Таким образом, компании, занимающиеся тропическими болезнями, часто должны сочетать свои исследовательские цели в области тропических болезней с исследованиями в других, более хорошо финансируемых областях медицинских исследований.

Био-МЭМС в тканевой инженерии

Культура клеток

Традиционная технология клеточных культур не позволяет эффективно проводить комбинаторное тестирование кандидатов в лекарственные препараты, факторов роста, нейропептидов, генов и ретровирусов в среде клеточной культуры. Из-за необходимости периодического кормления клеток свежей средой и пассажа даже для тестирования нескольких условий требуется большое количество клеток и расходных материалов, дорогие и громоздкие инкубаторы, большие объёмы жидкости (~0,1 — 2 мл на образец) и утомительный человеческий труд. Требование человеческого труда также ограничивает количество и продолжительность временных точек для экспериментов. Микрофлюидические клеточные культуры потенциально являются значительным улучшением, поскольку они могут быть автоматизированы, а также обеспечивают более низкую общую стоимость, более высокую пропускную способность и более количественное описание изменчивости поведения одной клетки. Включая системы газообмена и контроля температуры на чипе, микрофлюидическое культивирование клеток может устранить необходимость в инкубаторах и вытяжных шкафах для культуры тканей. Однако такой тип непрерывного микрофлюидического культивирования клеток также представляет свои уникальные проблемы. Контроль потока важен при посеве клеток в микроканалы, поскольку после первоначального введения клеточной суспензии поток необходимо остановить, чтобы клетки прикрепились или попали в микроячейки, диэлектрофоретические ловушки, микромагнитные ловушки или гидродинамические ловушки. Впоследствии поток необходимо возобновить таким образом, чтобы не создавать больших сил, отрывающих клетки от подложки. Дозирование жидкостей ручным или роботизированным пипетированием может быть заменено микронасосами и микроклапанами, где дозирование жидкости определяется просто, в отличие от систем непрерывного потока с помощью микромиксеров. Для изучения остеогенной дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека была разработана полностью автоматизированная микрофлюидная система клеточной культуры. Также был разработан портативный микрофлюидный инкубатор клеточных культур, способный нагревать и прокачивать растворы клеточных культур. Из-за уменьшения объёма в микрофлюидных культурах, собранные концентрации выше для лучшего измерения соотношения сигнал/шум, но сбор и обнаружение соответственно сложнее. Микроскопические анализы «in situ» с использованием микрофлюидных клеточных культур могут помочь в этом отношении, но имеют изначально более низкую пропускную способность из-за того, что зонд микроскопа имеет лишь небольшое поле зрения. Платформа Berkeley Lights Beacon решила проблему сбора и обнаружения путем проведения микрофлюидической культуры на массиве фотопроводников, которые могут быть оптоэлектрически активированы для манипулирования клетками на чипе. Эта платформа была принята компаниями Amgen и Novartis для разработки клеточных линий в биофармацевтической промышленности. Со-культуры с микрошаблонами также внесли свой вклад в био-МЭМС для тканевой инженерии, чтобы воспроизвести условия in vivo и трёхмерную естественную структуру. В частности, гепатоциты были созданы для совместного культивирования при определенной плотности клеток с фибробластами для поддержания специфических для печени функций, таких как секреция альбумина, синтез мочевины и детоксикация p450. Аналогичным образом, интеграция микрофлюидики с сокультурами с микрошаблонами позволила моделировать органы, в которых взаимодействуют многочисленные васкуляризированные ткани, такие как гематоэнцефалический барьер и легкие. Функции лёгких на уровне органа были воссозданы на устройствах «легкие-на-чипе», где пористая мембрана и посевной слой эпителиальных клеток циклически растягиваются под действием вакуума в соседних микроканалах для имитации вдоха.

Инженерия стволовых клеток

Интегрированное микрофлюидное устройство с генератором градиента концентрации и камерами для отдельных клеток для изучения дозозависимых эффектов факторов, индуцирующих дифференцировку. Целью инженерии стволовых клеток является возможность контролировать дифференцировку и самообновление плюрипотентных стволовых клеток для клеточной терапии. Дифференцировка стволовых клеток зависит от многих факторов, включая растворимые и биохимические факторы, напряжение сдвига жидкости, взаимодействие между клетками и ЭЦМ, взаимодействие между клетками, а также формирование и организацию эмбриоидных тел. Био-МЭМС использовались для исследования того, как оптимизировать условия культуры и роста стволовых клеток путём управления этими факторами. Анализ стволовых клеток и их дифференцированных потомков проводится с помощью микрочипов для изучения того, как транскрипционные факторы и миРНК определяют судьбу клеток, как эпигенетические модификации между стволовыми клетками и их дочерними клетками влияют на фенотипы, а также для измерения и сортировки стволовых клеток по экспрессии их белков.

Биохимические факторы

Микрофлюидика может использовать свой микроскопический объем и характеристики ламинарного потока для пространственно-временного контроля биохимических факторов, доставляемых в стволовые клетки. Микрофлюидические градиентные генераторы использовались для изучения зависимости доза-ответ. Кислород является важным биохимическим фактором, который необходимо учитывать при дифференцировке через индуцируемые гипоксией транскрипционные факторы (HIFs) и связанные с ними сигнальные пути, в частности, при развитии крови, сосудистой, плацентарной и костной тканей. Традиционные методы изучения влияния кислорода предполагали установку всего инкубатора на определенную концентрацию кислорода, что ограничивало анализ парными сравнениями между нормоксическими и гипоксическими условиями вместо желаемой характеристики, зависящей от концентрации. Разработанные решения включают использование непрерывных осевых градиентов кислорода и массивов микрофлюидных камер для клеточных культур, разделенных тонкими мембранами PDMS на микроканалы, заполненные газом.

Напряжение сдвига жидкости

Напряжение сдвига жидкости играет важную роль в дифференцировке стволовых клеток сердечно-сосудистых линий, а также в позднем эмбриогенезе и органогенезе, например, в формировании лево-правой асимметрии во время развития. Макромасштабные исследования не позволяют провести количественный анализ влияния напряжения сдвига на дифференцировку, поскольку они проводятся с использованием параллельно-пластинчатых проточных камер или вращающихся конусных аппаратов только в сценариях включения-выключения. Пуазейлевский поток в микрофлюидике позволяет систематически изменять напряжение сдвига с помощью геометрии канала и скорости потока через микронасосы, что было продемонстрировано на примере использования массивов перфузионных камер для изучения адгезии мезенхимальных стволовых клеток и клеток фибробластов.

Взаимодействие клеток и ЭЦМ

Взаимодействие клеток и ЭЦМ вызывает изменения в дифференцировке и самообновлении под влиянием жесткости субстрата посредством механотрансдукции и различных интегринов, взаимодействующих с молекулами ЭЦМ. В исследованиях взаимодействия стволовых клеток и ЭЦМ использовались микронанесение белков ЭЦМ с помощью микроконтактной печати (μCP), струйной печати и напыления масок. С помощью микроконтактной печати для контроля области прикрепления клеток было установлено, что переключение остеогенной/адипогенной линии в мезенхимальных стволовых клетках человека может зависеть от формы клеток. Изготовление микростолбиков и измерение их прогиба позволяет определить силу тяги, действующую на клетки. Фотолитография также может быть использована для сшивания фотополимеризуемого ЭКМ, засеянного клетками, для трёхмерных исследований. Использование микромассивов ECM для оптимизации комбинаторного воздействия коллагена, ламинина и фибронектина на стволовые клетки более выгодно, чем обычные луночные планшеты, благодаря более высокой пропускной способности и меньшей потребности в дорогостоящих реагентах.

Взаимодействие клеток с клетками

Судьба клеток регулируется как взаимодействиями между стволовыми клетками, так и взаимодействиями между стволовыми клетками и мембранными белками. Манипулирование плотностью посева клеток является распространённым биологическим методом контроля взаимодействия клеток с клетками, но контролировать локальную плотность сложно, и часто трудно разделить эффекты между растворимыми сигналами в среде и физическими взаимодействиями клеток с клетками. Микроразметка белков клеточной адгезии может быть использована для определения пространственного положения различных клеток на подложке для изучения пролиферации ЭСК человека. Посев стволовых клеток в микроячейки PDMS и переворачивание их на подложку или другой слой клеток — это метод достижения точного пространственного контроля. Связь через зазорный переход также изучалась с помощью микрофлюидики, когда отрицательное давление, создаваемое потоком жидкости в боковых каналах, фланкирующих центральный канал, захватывает пары клеток, находящихся в непосредственном контакте или разделённых небольшим зазором. Однако, в целом, ненулевая подвижность и короткое время клеточного цикла стволовых клеток часто нарушают пространственную организацию, навязанную этими микротехнологиями.

Формирование и организация эмбриоидных тел

Эмбриоидные тела мыши в суспензионной культуре через 24 часа после образования из эмбриональных стволовых клеток. Эмбриоидные тела являются обычным тестом in vitro на плюрипотентность стволовых клеток, и их размер необходимо контролировать, чтобы вызвать направленную дифференциацию в определенные линии. Высокопроизводительное формирование эмбриоидных тел одинакового размера с помощью микроячеек и микрофлюидики позволяет легко извлекать их и, что более важно, масштабировать для клинических условий. Активное управление организацией и архитектурой клеток эмбриоидного тела может также направлять дифференцировку стволовых клеток с помощью микрофлюидных градиентов факторов, индуцирующих эндодерму, мезодерму и эктодерму, а также факторов самообновления.

Вспомогательные репродуктивные технологии

Вспомогательные репродуктивные технологии помогают лечить бесплодие и генетически улучшать скот. Однако эффективность этих технологий в криоконсервации и производстве эмбрионов млекопитающих in vitro низка. Микрофлюидика применяется в этих технологиях для лучшего имитирования микросреды in vivo с помощью топографических и биохимических поверхностей для контролируемой пространственно-временной адгезии клеток, а также минимизации мёртвых объёмов. Микронасосы и микроклапаны позволяют автоматизировать утомительные процедуры дозирования жидкости, а различные датчики могут быть интегрированы для контроля качества в режиме реального времени. Био-МЭМС устройства были разработаны для оценки подвижности сперматозоидов, селекции сперматозоидов, а также для предотвращения полиспермии при экстракорпоральном оплодотворении.

Био-МЭМС в медицинских имплантатах и хирургии

Имплантируемые микроэлектроды

Целью имплантируемых микроэлектродов является взаимодействие с нервной системой организма для записи и отправки биоэлектрических сигналов для изучения заболеваний, улучшения протезов и мониторинга клинических параметров. Микрофабрикация привела к разработке мичиганских зондов и электродного массива Юта, которые позволили увеличить количество электродов на единицу объёма, одновременно решив проблемы толстых подложек, вызывающих повреждения при имплантации и провоцирующих реакцию инородного тела, и инкапсуляции электродов через кремний и металлы в электродах. Мичиганские зонды были использованы для крупномасштабной записи и сетевого анализа нейронных ансамблей, а электродный массив Юты был использован в качестве интерфейса мозг-компьютер для парализованных людей. Внеклеточные микроэлектроды были нанесены на надувной пластик в форме спирали в кохлеарных имплантах для более глубокого введения и лучшего контакта электродов с тканями для передачи звуков высокой точности. Интеграция микроэлектроники в тонкие гибкие подложки привела к разработке кардиологического пластыря, который приклеивается к криволинейной поверхности сердца только за счёт поверхностного натяжения, для измерения электрофизиологии сердца, а также электронных татуировок для измерения температуры кожи и биоэлектричества. Беспроводная запись электрофизиологических сигналов возможна благодаря добавлению пьезокристалла в цепь из двух регистрирующих электродов и одного транзистора на имплантируемом микроустройстве. Внешний преобразователь излучает импульсы ультразвуковой энергии}, которые воздействуют на пьезокристалл, и изменения внеклеточного напряжения обратно рассеиваются ультразвуком на пьезокристалле, что позволяет проводить измерения. Сеть так называемых «нейронных пылевых» мотыльков может составить карту сигналов по всей области тела, где имплантированы микродатчики.

Микроинструменты для хирургии

Кардиологический баллонный катетер с температурными датчиками, датчиками электрокардиографии и светодиодами — это хирургическая био-МЭМС. Био-МЭМС для хирургического применения могут улучшить существующую функциональность, добавить новые возможности для хирургов при разработке новых техник и процедур, а также улучшить результаты хирургического вмешательства за счёт снижения риска и обеспечения обратной связи в реальном времени во время операции. Микрообработанные хирургические инструменты, такие как крошечные щипцы, микроиглы и дебридеры тканей, стали возможны благодаря методам послойной микрофабрикации металла и керамики для минимально инвазивной хирургии и роботизированной хирургии. Встраивание датчиков в хирургические инструменты также позволяет обеспечить тактильную обратную связь для хирурга, определить тип ткани по деформации и плотности во время операций разрезания, а также проводить диагностическую катетеризацию для измерения кровотока, давления, температуры, содержания кислорода и концентрации химических веществ.

Доставка лекарств

Трансдермальный пластырь с микроиглами менее инвазивен по сравнению с традиционной доставкой лекарств с помощью подкожной иглы. Микроиглы, рецептурные системы и имплантируемые системы являются био-МЭМС, применимыми для доставки лекарств. Микроиглы размером около 100 мкм могут проникать через кожный барьер и доставлять лекарственные препараты в нижележащие клетки и интерстициальную жидкость с меньшим повреждением тканей, меньшей болью и без кровотечения. Микроиглы также могут быть интегрированы с микрофлюидикой для автоматизированной загрузки лекарств или мультиплексирования. С точки зрения пользователя, микроиглы могут быть включены в формат пластыря для самостоятельного введения препарата и не представляют биологической опасности в виде острых отходов (если материал полимерный). Доставка лекарств с помощью микроигл включает покрытие поверхности терапевтическими агентами, загрузку лекарств в пористые или полые микроиглы или изготовление микроигл с лекарством и матрицей покрытия для максимальной загрузки лекарства. Также разрабатываются микроиглы для забора интерстициальной жидкости, забора крови и доставки генов. Эффективность доставки лекарств с помощью микроигл остаётся сложной задачей, поскольку трудно определить, насколько эффективно микроиглы проникли в кожу. Некоторые лекарства, такие как диазепам, плохо растворимы и должны быть аэрозолированы непосредственно перед интраназальным введением.Технология Bio-MEMS с использованием пьезоэлектрических преобразователей в жидкие резервуары может быть использована в этих условиях для создания узкого распределения аэрозолей по размерам для лучшей доставки лекарств. Имплантируемые системы доставки лекарств также были разработаны для введения терапевтических агентов, которые имеют низкую биодоступность или требуют локального высвобождения и воздействия на целевой участок. Примеры включают микрофлюидное устройство из ПДМС, имплантируемое под конъюнктиву для доставки лекарств в глаз для лечения глазных заболеваний, и микрочипы с золотыми резервуарами для лекарств при остеопорозе. В имплантируемых био-МЭМС для доставки лекарств важно учитывать возможность разрыва устройства и сброса дозы, фиброзную инкапсуляцию устройства и его эксплантацию. Большинство лекарств также необходимо доставлять в относительно больших количествах (миллилитры или даже больше), что делает доставку лекарств в имплантируемых био-МЭМС сложной задачей из-за их ограниченной способности удерживать лекарство.