Методы генетической инженерии

Материал из Циклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Translation2.png
 Необходимо проверить качество перевода и привести статью в соответствие со стилистическими правилами Циклопедии.
Вы можете помочь улучшить эту статью, исправив в ней ошибки.

Оригинал не указан. Пожалуйста, укажите его.

Эта отметка стоит на статье с 5 Декабря 2020.
Как работает генетическая инженерия [16:36]
Генная инженерия. Как редактируют ДНК, и возможно ли создавать генно-модифицированных людей? (В новом «Толке» молекулярный биолог Константин Северинов объяснит технологию редактирования ДНК буквально на пальцах) // РБК Тренды [16:36]

Методы генетической инженерии - это ряд шагов, которые выполняются перед созданием генетически модифицированного организма (ГМО). Генные инженеры должны сначала выбрать какой ген они хотят вставить, изменить или удалить. Затем ген должен быть выделен и включен вместе с другими генетическими элементами в подходящий вектор. Этот вектор затем используется для вставки гена в геном хозяина, создавая трансгенный или отредактированный организм. Способность к генной инженерии организмов основана на многолетних исследованиях и открытиях о том, как функционируют гены и как можно ими манипулировать. Важные достижения включали открытие рестрикционных ферментов и ДНК-лигаз, а также разработку полимеразной цепной реакции и секвенирования.

У животных ген обычно вводится в эмбриональные стволовые клетки, в то время как у растений он может быть введен в любую ткань, которая может быть культивирована в полностью развитое растение. Общие методы включают микроинъекцию, вирус-опосредованную, агробактериальную или биолистическую. Чтобы обеспечить стабильную интеграцию, наследование и экспрессию, на полученном организме проводятся дальнейшие тесты. Потомство первого поколения гетерозиготно, что требует от них инбредности для создания гомозиготного паттерна, необходимого для стабильного наследования. Гомозиготность должна быть подтверждена в образцах второго поколения.

Традиционные методы вставляли гены в геном хозяина случайным образом. Достижения позволили генам быть вставленными в определенные места в геноме, что уменьшает непреднамеренные побочные эффекты случайной вставки. Ранние системы таргетирования опирались на мегануклеазы и нуклеазы цинковых пальцев. С 2009 года были разработаны более точные и простые в реализации системы. Наиболее часто используются активаторные эффекторные нуклеазы транскрипции (TALENs) и система Cas9-guideRNA (адаптированная из CRISPR). Они потенциально могут быть полезны в генной терапии и других процедурах, требующих точного или высокопроизводительного таргетирования.

История[править]

Множество различных открытий и достижений привели к развитию генной инженерии. Управляемые человеком генетические манипуляции начались с одомашнивания растений и животных с помощью искусственного отбора примерно в 12000 году до нашей эры.[1] Гибридизация была одним из способов быстрого изменения генетического состава организма. Гибридизация культур, скорее всего, впервые произошла, когда люди начали выращивать генетически отличные особи родственных видов в непосредственной близости.[2][3]Некоторые растения были способны размножаться путем вегетативного клонирования.[2][4]

Генетическое наследование было впервые открыто Грегором Менделем в 1865 году после экспериментов по скрещиванию гороха. В 1928 году Фредерик Гриффит доказал существование "трансформирующего принципа", связанного с наследованием, который был идентифицирован как ДНК в 1944 году Освальдом Эйвери, Колином Маклеодом и Маклином Маккарти. Фредерик Сэнгер разработал метод секвенирования ДНК в 1977 году, значительно увеличив генетическую информацию, доступную исследователям.

После открытия существования и свойств ДНК необходимо было разработать инструменты, позволяющие манипулировать ею. В 1970 году лаборатория Гамильтона Смита обнаружила ферменты рестрикции, позволившие ученым выделить гены из генома организма.[5] ДНК-лигазы, которые соединяют сломанную ДНК вместе, были открыты ранее в 1967 году.[6] Объединив эти два фермента, стало возможным "вырезать и вставлять" последовательности ДНК для создания рекомбинантной ДНК. Плазмиды, открытые в 1952 году, стали важными инструментами для передачи информации между клетками и репликации последовательностей ДНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), разработанная Кэри Маллисом в 1983 году, позволила амплифицировать (реплицировать) небольшие участки ДНК и помогла идентифицировать и выделить генетический материал.

Помимо манипуляций с ДНК, необходимо было разработать методы ее внедрения в геном организма. Эксперимент Гриффита уже показал, что некоторые бактерии обладают способностью естественным образом поглощать и экспрессировать чужеродную ДНК. Искусственная компетентность была индуцирована у кишечной палочки в 1970 году путем обработки их раствором хлорида кальция (CaCl2).[7]Трансформация с использованием электропорации была разработана в конце 1980-х годов, что повысило эффективность и бактериальный диапазон. В 1907 году была обнаружена бактерия, вызывающая опухоли растений - Agrobacterium tumefaciens. В начале 1970-х годов было обнаружено, что эта бактерия вводила свою ДНК в растения с помощью плазмиды Ti.[8]Удалив гены из плазмиды, вызвавшей опухоль, и добавив новые гены, исследователи смогли заразить растения A. tumefaciens и позволить бактериям вставить выбранную ими ДНК в геномы растений.[9]

Выбор целевых генов[править]

Первым шагом является идентификация целевого гена или генов, которые необходимо внедрить в организм хозяина. Это обусловлено целью для результирующего организма. В некоторых случаях поражается только один или два гена. Для более сложных целей могут быть задействованы целые биосинтетические пути, включающие несколько генов. Однажды найденные гены и другая генетическая информация из широкого спектра организмов могут быть вставлены в бактерии для хранения и модификации, создавая в процессе генетически модифицированные бактерии. Бактерии дешевы, легко растут, клонируются, быстро размножаются, относительно легко трансформируются и могут храниться при температуре -80 °C почти бесконечно. Как только ген выделен, он может храниться внутри бактерий, обеспечивая неограниченный запас для исследований.[10]

Генетические скрининги могут быть проведены для определения потенциальных генов, а затем другие тесты выявляют лучших кандидатов. Простой экран включает в себя случайную мутацию ДНК с помощью химических веществ или излучения, а затем выбор тех, которые отображают желаемый признак. Для организмов, где мутация не практична, ученые вместо этого ищут особей среди популяции, которые представляют характеристику через естественные мутации. Процессы, которые смотрят на фенотип, а затем пытаются идентифицировать ответственный ген, называются прямой генетикой. Затем ген должен быть картирован путем сравнения наследования фенотипа с известными генетическими маркерами. Гены, которые находятся близко друг к другу, скорее всего, будут унаследованы вместе.[11]

Другой вариант - обратная генетика. Этот подход предполагает нацеливание на конкретный ген с мутацией, а затем наблюдение за тем, какой фенотип развивается. Мутация может быть сконструирована так, чтобы инактивировать ген или позволить ему стать активным только при определенных условиях. Условные мутации полезны для идентификации генов, которые обычно летальны, если они нефункциональны.[12] Поскольку гены со сходными функциями имеют сходные (гомологичные) последовательности , можно предсказать вероятную функцию гена, сравнив его последовательность с последовательностью хорошо изученных генов модельных организмов. Развитие микрочипов, транскриптомов и секвенирования генома значительно облегчило поиск нужных генов.[13]

Бактерия Bacillus thuringiensis была впервые обнаружена в 1901 году как возбудитель гибели шелкопрядов. Благодаря этим инсектицидным свойствам бактерия была использована в качестве биологического инсектицида, разработанного промышленно в 1938 году. Cry-токсины были открыты для обеспечения инсектицидной активности в 1956 году, а к 1980-м годам ученые успешно клонировали ген, кодирующий этот токсин, и экспрессировали его в растениях.[14] Ген, обеспечивающий устойчивость к гербициду глифосату, был обнаружен после семи лет поисков у бактерий, живущих в трубе оттока на заводе Monsanto RoundUp.[15] У животных большинство используемых генов - это гены гормона роста.[16]

Генные манипуляции[править]

Все процессы генной инженерии связаны с модификацией ДНК. Традиционно ДНК выделяли из клеток организмов. Позже гены стали клонироваться из сегмента ДНК после создания библиотеки ДНК или искусственно синтезироваться. После выделения к гену добавляются дополнительные генетические элементы, позволяющие ему экспрессироваться в организме хозяина и способствующие отбору.

Извлечение из клеток[править]

Сначала клетку нужно осторожно вскрыть, обнажив ДНК, не причинив ей слишком большого вреда. Используемые методы варьируются в зависимости от типа ячейки. После открытия ДНК должна быть отделена от других клеточных компонентов. Разорванная клетка содержит белки и другой клеточный мусор. Путем смешивания с фенолом и/или хлороформом с последующим центрифугированием нуклеиновые кислоты могут быть отделены от этого остатка в верхнюю водную фазу. Эта водная фаза может быть удалена и при необходимости дополнительно очищена путем повторения фенол-хлороформных стадий. Затем нуклеиновые кислоты могут быть осаждены из водного раствора с помощью этанола или изопропанола. Любая РНК может быть удалена путем добавления рибонуклеазы, которая разрушит ее. Многие компании теперь продают наборы, которые упрощают этот процесс.[17]

Изоляция генов[править]

Ген, представляющий интерес, должен быть отделен от извлеченной ДНК. Если последовательность неизвестна, то распространенным методом является расщепление ДНК методом случайного переваривания. Это обычно достигается с помощью ферментов рестрикции (ферментов, которые разрезают ДНК). Частичный рестрикционный дайджест сокращает только некоторые из сайтов рестрикции, что приводит к перекрытию сегментов фрагментов ДНК. Фрагменты ДНК помещают в отдельные плазмидные векторы и выращивают внутри бактерий. Попав в бактерии, плазмида копируется по мере деления бактерий. Чтобы определить, присутствует ли полезный ген на конкретном фрагменте, библиотека ДНК проверяется на наличие желаемого фенотипа. Если фенотип обнаружен, то вполне возможно, что бактерия содержит целевой ген.

Если ген не имеет обнаруживаемого фенотипа или библиотека ДНК не содержит правильного гена,для его выделения необходимо использовать другие методы. Если ген выражает близкую гомологию с известным геном у другого вида, то его можно выделить путем поиска в библиотеке генов, которые близко соответствуют известному гену.[18]

Для известных последовательностей ДНК могут быть использованы ферменты рестрикции, которые разрезают ДНК с обеих сторон гена. Затем электрофорез в полиакриламидном геле сортирует фрагменты по длине.[19] Некоторые электрофорезы могут разделять последовательности, отличающиеся одной парой оснований. ДНК можно визуализировать, окрашивая ее бромистым этидием и фотографируя в ультрафиолетовом свете. Маркер с фрагментами известной длины может быть положен рядом с ДНК, чтобы оценить размер каждой полосы. Полоса ДНК правильного размера должна содержать ген, где он может быть вырезан из электрофореза.[20][21]Другой метод выделения генов известных последовательностей включает полимеразную цепную реакцию (ПЦР).[22] ПЦР - это мощный инструмент, который может амплифицировать данную последовательность, которая затем может быть выделена с помощью гель-электрофореза. Его эффективность падает с увеличением числа генов, и он может вносить ошибки в последовательность.

Можно искусственно синтезировать гены в коммерческих целях.[23][24]

Модификация[править]

Ген, который должен быть вставлен, должен быть объединен с другими генетическими элементами. На этой стадии ген может быть модифицирован для лучшей экспрессии или эффективности. Помимо гена, который должен быть вставлен, большинство конструкций содержат промоторную и терминаторную области, а также выбираемый маркерный ген. Промоторная область инициирует транскрипцию гена и может использоваться для контроля местоположения и уровня экспрессии гена, в то время как терминаторная область завершает транскрипцию. Селективный маркер, который в большинстве случаев придает устойчивость к антибиотикам организму, в котором он экспрессируется, используется для определения того, какие клетки трансформируются с новым геном. Конструкции изготавливаются с использованием методов рекомбинантной ДНК, таких как рестрикционные переваривания, лигирование и молекулярное клонирование.[25]

Вставка ДНК в геном хозяина[править]

Как только ген сконструирован, он должен быть устойчиво интегрирован в геном организмов-мишеней или существовать как внехромосомная ДНК. Существует ряд методов, доступных для вставки гена в геном хозяина, и они варьируются в зависимости от типа организма-мишени. У многоклеточных эукариот, если трансген включен в зародышевые клетки хозяина, полученная клетка-хозяин может передать трансген своему потомству. Если трансген инкорпорирован в соматические клетки, он не может быть унаследован.[26]

Преобразование[править]

Бактериальная трансформация включает в себя перемещение гена от одной бактерии к другой. Он интегрируется в плазмиду реципиента. и тогда может быть выражен новым хозяином.

Трансформация - это прямое изменение генетических компонентов клетки путем прохождения генетического материала через клеточную мембрану. Около 1% бактерий естественным образом способны поглощать чужеродную ДНК, но эта способность может быть индуцирована и у других бактерий.[27]Стресс бактерий тепловым шоком или электропорацией может сделать клеточную мембрану проницаемой для ДНК, которая затем может быть включена в геном или существовать как экстрахромосомная ДНК. Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентные катионы (часто хлорид кальция), в холодных условиях, прежде чем подвергнуть их воздействию теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникать в клетку-хозяина. Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентных катионов в холодном состоянии может изменить или ослабить структуру поверхности клетки, сделав ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс через клеточную мембрану, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через поры клетки, либо через поврежденную клеточную стенку. Электропорация - еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки коротко шокируют электрическим полем 10-20 кв/см, которое, как полагают, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникнуть плазмидная ДНК. После поражения электрическим током отверстия быстро закрываются механизмами восстановления мембран клетки. Взятая вверх ДНК может либо интегрироваться с геномом бактерий, либо, что более распространено, существовать как внехромосомная ДНК.

В растениях ДНК часто вставляется с помощью опосредованной агробактериями рекомбинации используя преимущества последовательности Т-ДНК агробактерий, которая позволяет естественным образом вводить генетический материал в растительные клетки.[28] Растительные ткани разрезают на мелкие кусочки и замачивают в жидкости, содержащей взвешенные агробактерии. Бактерии прикрепятся ко многим растительным клеткам, подвергшимся воздействию порезов. Бактерии используют конъюгацию для переноса сегмента ДНК, называемого Т-ДНК, из своей плазмиды в растение. Перенесенная ДНК пилотируется к ядру растительной клетки и интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина. Плазмидная Т-ДНК полуслучайно интегрируется в геном клетки-хозяина.[29]

Модифицируя плазмиду для экспрессии интересующего гена, исследователи могут стабильно вводить выбранный ими ген в геном растений. Единственными существенными частями Т-ДНК являются два ее небольших (25 пар оснований) пограничных повтора, по крайней мере один из которых необходим для трансформации растений.[30][4]Гены, которые должны быть введены в растение, клонируются в вектор трансформации растения, содержащий область Т-ДНК плазмиды. Альтернативным методом является агроинфильтрация.[31]

Другим методом, используемым для трансформации растительных клеток, является биолистика, когда частицы золота или вольфрама покрываются ДНК, а затем выстреливаются в молодые растительные клетки или эмбрионы растений. Некоторый генетический материал проникает в клетки и трансформирует их. Этот метод может быть использован на растениях, не восприимчивых к агробактериальной инфекции, а также позволяет трансформировать пластиды растений. Клетки растений также могут быть трансформированы с помощью электропорации, которая использует электрический шок, чтобы сделать клеточную мембрану проницаемой для плазмидной ДНК. Из-за повреждения клеток и ДНК эффективность трансформации биолистики и электропорации ниже, чем агробактериальной трансформации.

Трансфекция[править]

Трансформация имеет другое значение по отношению к животным, указывая на прогрессирование до ракового состояния, поэтому процесс, используемый для вставки чужеродной ДНК в клетки животных, обычно называют трансфекцией.[32] Существует множество способов прямого введения ДНК в клетки животных in vitro. Часто эти клетки являются стволовыми клетками, которые используются для генной терапии. Химические методы используют природные или синтетические соединения для образования частиц, которые облегчают перенос генов в клетки.[33] Эти синтетические векторы обладают способностью связывать ДНК и приспосабливаться к большим генетическим переносам. Один из простейших методов заключается в использовании фосфата кальция для связывания ДНК и последующего воздействия на культивируемые клетки. Раствор вместе с ДНК инкапсулируется клетками. Липосомы и полимеры могут быть использованы в качестве векторов для доставки ДНК в культивируемые клетки животных. Положительно заряженные липосомы связываются с ДНК, в то время как полимеры могут быть сконструированы, которые взаимодействуют с ДНК. Они образуют липоплексы и полиплексы соответственно,которые затем поглощаются клетками. Другие методы включают использование электропорации и биолистики.В некоторых случаях трансфицированные клетки могут стабильно интегрировать внешнюю ДНК в свой собственный геном, этот процесс известен как стабильная трансфекция.[20]

Для создания трансгенных животных ДНК должна быть вставлена в жизнеспособные эмбрионы или яйцеклетки. Это обычно достигается с помощью микроинъекции, когда ДНК вводится через ядерную оболочку клетки непосредственно в ядро. Когда пронуклеусы из головки сперматозоида и яйцеклетки видны сквозь протоплазму, в один из них вводится генетический материал. Затем яйцеклетка имплантируется в яйцевод псевдопрегнантного животного.[21] Другой метод - опосредованный эмбриональными стволовыми клетками перенос генов. Ген трансфицируется в эмбриональные стволовые клетки, а затем они вставляются в бластоцисты мышей, которые затем имплантируются приемным матерям. Полученное потомство химерно, и дальнейшее спаривание может привести к появлению мышей, полностью трансгенных с интересующим геном.[34]

Трансдукция[править]

Трансдукция - это процесс, посредством которого чужеродная ДНК вводится в клетку вирусом или вирусным вектором.[43] Генетически модифицированные вирусы могут быть использованы в качестве вирусных векторов для передачи генов-мишеней другому организму в генной терапии.Сначала вирулентные гены удаляются из вируса, а вместо них вставляются гены-мишени. Последовательности, которые позволяют вирусу вводить гены в организм хозяина, должны быть оставлены нетронутыми. Популярные вирусные векторы развиваются из ретровирусов или аденовирусов. Другие вирусы, используемые в качестве векторов, включают лентивирусы, вирусы оспы и вирусы герпеса. Тип используемого вируса будет зависеть от клеток-мишеней и от того, будет ли ДНК изменена навсегда или временно.

Регенерация[править]

Поскольку часто только одна клетка трансформируется генетическим материалом, организм должен быть регенерирован из этой единственной клетки. У растений это достигается с помощью культуры тканей.[35][36]Каждый вид растений имеет различные требования для успешной регенерации. В случае успеха метод производит взрослое растение, которое содержит трансген в каждой клетке.[11] У животных необходимо убедиться, что вставленная ДНК присутствует в эмбриональных стволовых клетках. Потомство может быть подвергнуто скринингу на наличие этого гена. Все потомки первого поколения гетерозиготны по введенному гену и должны быть инбредными для получения гомозиготного образца. Бактерии состоят из одной клетки и размножаются клонированно, поэтому регенерация не требуется. Дискретные маркеры используются для того, чтобы легко отличить трансформированные клетки от нетрансформированных.

Клетки, которые были успешно трансформированы с помощью ДНК, содержат маркерный ген, в то время как те, которые не трансформированы, не будут. Выращивая клетки в присутствии антибиотика или химического вещества, которое выделяет или маркирует клетки, экспрессирующие этот ген, можно отделить модифицированные клетки от немодифицированных. Другой метод скрининга включает в себя ДНК-зонд, который прилипает только к вставленному гену. Эти маркеры обычно присутствуют в трансгенном организме, хотя был разработан ряд стратегий, которые могут удалить селективный маркер из зрелого трансгенного растения.[37]

Подтверждение[править]

Обнаружение того, что рекомбинантный организм содержит вставленные гены, обычно недостаточно для того, чтобы гарантировать, что они будут надлежащим образом экспрессироваться в предполагаемых тканях. Дальнейшее тестирование с использованием ПЦР, Южной гибридизации и секвенирования ДНК проводится для подтверждения того, что организм содержит новый ген.[38] Эти тесты также могут подтвердить хромосомное расположение и номер копии вставленного гена. После подтверждения методы, которые ищут и измеряют генные продукты(РНК и белок), также используются для оценки экспрессии генов, транскрипции, паттернов обработки РНК, а также экспрессии и локализации белковых продуктов. К ним относятся Северная гибридизация, количественная от-ПЦР, Вестерн-Блот, иммунофлуоресценция, ИФА и фенотипический анализ.[39] При необходимости потомство организма изучают, чтобы подтвердить, что трансген и связанный с ним фенотип стабильно наследуются.

Генный таргетинг[править]

Традиционные методы генной инженерии обычно вводят новый генетический материал случайным образом в геном хозяина. Это может ухудшить или изменить другие гены в организме. Были разработаны методы введения нового генетического материала в определенные участки генома организма. Ранние методы, нацеленные на гены в определенных участках генома, основывались на гомологичной рекомбинации.[40] Создавая ДНК-конструкции, содержащие шаблон, соответствующий целевой последовательности генома, вполне возможно, что HR-процессы внутри клетки вставят конструкцию в нужное место. Использование этого метода на эмбриональных стволовых клетках привело к развитию трансгенных мышей с целенаправленным нокаутом. Кроме того, было возможно стучать в гены или изменять паттерны экспрессии генов.

Если жизненно важный ген выбит, он может оказаться смертельным для организма. Для изучения функции этих генов были использованы сайт-специфичные рекомбиназы (SSR). Двумя наиболее распространенными типами являются системы Cre-LoxP и Flp-FRT. Рекомбиназа Cre-это фермент, который удаляет ДНК путем гомологичной рекомбинации между связывающими последовательностями, известными как сайты Lox-P. Система Flip-FRT работает аналогичным образом, причем Flip-рекомбиназа распознает последовательности FRT. Скрещивая организм, содержащий участки рекомбиназы, фланкирующие интересующий ген, с организмом, экспрессирующим SSR под контролем тканеспецифических промоторов, можно нокаутировать или включить гены только в определенных клетках. Это также было использовано для удаления маркерных генов у трансгенных животных. Дальнейшие модификации этих систем позволили исследователям индуцировать рекомбинацию только при определенных условиях, позволяя генам быть нокаутированными или экспрессированными в нужное время или на нужных стадиях развития.[41]

Редактирование генома использует искусственно сконструированные нуклеазы, которые создают специфические двухцепочечные разрывы в нужных местах генома. Разрывы подвергаются процессам клеточной репарации ДНК, которые могут быть использованы для целенаправленного выбивания, коррекции или вставки генов на высоких частотах. Если присутствует донорская ДНК, содержащая соответствующую последовательность (гомологии), то новый генетический материал, содержащий трансген, будет интегрирован в целевой сайт с высокой эффективностью путем гомологичной рекомбинации.[42] Существует четыре семейства инженерных нуклеаз: мегануклеазы, ZFNs, Транскрипционные активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALEN), CRISPR/Cas (кластеризованный регулярно чередующийся короткий палиндромный повтор/CRISPR-ассоциированный белок (напр. CRISPR/Cas9).[43] Среди четырех типов наиболее часто используются TALEN и CRISPR/Cas. Недавние достижения были направлены на объединение нескольких систем для использования лучших особенностей обеих (например, мегатал, который представляет собой слияние домена связывания ДНК TALE и мегануклеазы). Недавние исследования также были сосредоточены на разработке стратегий создания генного нокаута или коррекции без создания двухцепочечных разрывов (базовых редакторов).[44]

Мегануклеазы и нуклеазы цинкового пальца[править]

Мегануклеазы впервые были использованы в 1988 году в клетках млекопитающих. Мегануклеазы - это эндодезоксирибонуклеазы, которые функционируют как ферменты рестрикции с длинными сайтами распознавания, что делает их более специфичными для своего целевого сайта, чем другие ферменты рестрикции. Это повышает их специфичность и снижает их токсичность, поскольку они не будут нацелены на такое количество сайтов в геноме. Наиболее изученными мегануклеазами являются семейства LAGLIDADG. В то время как мегануклеазы все еще довольно восприимчивы к нецелевому связыванию, что делает их менее привлекательными, чем другие инструменты редактирования генов, их меньший размер все еще делает их привлекательными, особенно для перспектив вирусной векторизации.[45]

Нуклеазы цинкового пальца (ZFNs), впервые использованные в 1996 году, обычно создаются путем слияния доменов цинкового пальца и домена нуклеазы Фоки. Таким образом, ZFNs обладают способностью расщеплять ДНК в целевых участках. Сконструировав домен цинкового пальца так, чтобы он был нацелен на определенный участок в геноме, можно отредактировать геномную последовательность в нужном месте. ZFNs обладают большей специфичностью, но все же обладают потенциалом связывания с неспецифическими последовательностями. Хотя определенное количество нецелевого расщепления приемлемо для создания трансгенных модельных организмов, они могут быть не оптимальными для всех методов генной терапии человека.[46]

TALEN и CRISPR[править]

Доступ к коду, регулирующему распознавание ДНК транскрипционными активатороподобными эффекторами (TALE), в 2009 году открыл путь к разработке нового класса эффективных инструментов редактирования генов на основе TAL. Белки, секретируемые растительным патогеном Xanthomonas, связываются с большой специфичностью с генами внутри растения-хозяина и инициируют транскрипцию генов, способствующих инфекции. Инженерное создание TALE путем слияния ДНК-связывающего ядра с каталитическим доменом нуклеазы FokI позволило создать новый инструмент конструкторских нуклеаз-НУКЛЕАЗУ TALE (TALEN).[47] Они обладают одной из самых больших специфических особенностей из всех современных инженерных нуклеаз. Из-за наличия повторяющихся последовательностей их трудно сконструировать с помощью стандартной процедуры молекулярной биологии и полагаться на более сложный метод, такой как клонирование Золотых ворот.

В 2011 году была разработана еще одна крупная прорывная технология, основанная на системах CRISPR/Cas, которые функционируют как адаптивная иммунная система у бактерий и архей. Система CRISPR/Cas позволяет бактериям и археям бороться с вторгающимися вирусами, расщепляя вирусную ДНК и вставляя кусочки этой ДНК в свой собственный геном. Затем организм транскрибирует эту ДНК в РНК и объединяет эту РНК с белками Cas9, чтобы сделать двухцепочечные разрывы в вторгающейся вирусной ДНК. РНК служит в качестве направляющей РНК для направления фермента Cas9 к нужному месту в вирусной ДНК. Спаривая белки Cas с разработанной направляющей РНК, CRISPR/Cas9 можно использовать для индуцирования двухцепочечных разрывов в определенных точках последовательностей ДНК. Разрыв восстанавливается клеточными ферментами репарации ДНК, создавая в большинстве случаев небольшую мутацию типа вставки / делеции. Целенаправленная репарация ДНК возможна путем предоставления донорского шаблона ДНК, который представляет собой желаемое изменение и который (иногда) используется для репарации двухцепочечных разрывов путем гомологичной рекомбинации. Позже было продемонстрировано, что CRISPR/Cas9 может редактировать человеческие клетки в чашке. Хотя раннему поколению не хватает специфики TALEN, основным преимуществом этой технологии является простота конструкции. Он также позволяет одновременно нацеливаться на несколько сайтов, позволяя редактировать сразу несколько генов. CRISPR/Cpf1 - это более недавно открытая система, которая требует другой направляющей РНК для создания особых двухцепочечных разрывов (листья нависают при расщеплении ДНК) по сравнению с CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9 эффективен при разрушении генов. Создание ВИЧ-резистентных младенцев китайским исследователем Хэ Цзянькуем является, пожалуй, самым известным примером нарушения генов с помощью этого метода. Он гораздо менее эффективен при генной коррекции. В настоящее время разрабатываются методы редактирования оснований, в которых “мертвая нуклеаза” Cas 9 эндонуклеаза или связанный с ней фермент используются для таргетирования генов, в то время как связанный фермент дезаминаза производит целевое изменение основания в ДНК. Самое последнее усовершенствование CRISPR-Cas9 называется Prime Editing. Этот метод связывает обратную транскриптазу с РНК-управляемой инженерной нуклеазой, которая делает только одноцепочечные разрезы, но не разрывает двухцепочечные. Он заменяет часть ДНК рядом с разрезом последовательным действием нуклеазы и обратной транскриптазы, внося желаемое изменение из шаблона РНК.[48]

См. также[править]

Генетическая инженерия

Источники[править]

  1. ↑ Clive Roots Domestication. — Greenwood Publishing Group, 2007. — 231 с. — ISBN 978-0-313-33987-5.
  2. ↑ 2,0 2,1 Noel Kingsbury Hybrid: The History and Science of Plant Breeding. — University of Chicago Press, 2009-10-15. — 511 с. — ISBN 978-0-226-43705-7.
  3. ↑ Методы генной инженерии.
  4. ↑ 4,0 4,1 H. Joos, B. Timmerman, M. Van Montagu, J. Schell Genetic analysis of transfer and stabilization of Agrobacterium DNA in plant cells // The EMBO Journal. — 1983. — В. 12. — Vol. 2. — С. 2151–2160. — ISSN 0261-4189.
  5. ↑ Richard J. Roberts How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2005-04-26. — В. 17. — Vol. 102. — С. 5905–5908. — ISSN 0027-8424. — DOI:10.1073/pnas.0500923102
  6. ↑ B Weiss, C C Richardson Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, I. Repair of single-strand breaks in DNA by an enzyme system from Escherichia coli infected with T4 bacteriophage. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1967-04. — В. 4. — Vol. 57. — С. 1021–1028. — ISSN 0027-8424.
  7. ↑ M. Mandel, A. Higa Calcium-dependent bacteriophage DNA infection (англ.) // Journal of Molecular Biology. — 1970-10-14. — В. 1. — Vol. 53. — С. 159–162. — ISSN 0022-2836. — DOI:10.1016/0022-2836(70)90051-3
  8. ↑ Agrobacterium: The Natural Genetic Engineer 100 Years Later (2012-10-19). Проверено 3 декабря 2020.
  9. ↑ P. Zambryski, H. Joos, C. Genetello, J. Leemans, M. Van Montagu Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity // The EMBO Journal. — 1983. — В. 12. — Vol. 2. — С. 2143–2150. — ISSN 0261-4189.
  10. ↑ Выбор целевых генов.
  11. ↑ 11,0 11,1 Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts Studying Gene Expression and Function (англ.) // Molecular Biology of the Cell. 4th edition. — 2002.
  12. ↑ Anthony JF Griffiths, Jeffrey H. Miller, David T. Suzuki, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart Mutant types (англ.) // An Introduction to Genetic Analysis. 7th edition. — 2000.
  13. ↑ Hee-Jong Koh, Suk-Yoon Kwon, Michael Thomson Current Technologies in Plant Molecular Breeding: A Guide Book of Plant Molecular Breeding for Researchers. — Springer, 2015-08-26. — 360 с. — ISBN 978-94-017-9996-6.
  14. ↑ Jong Yul Roh, Jae Young Choi, Ming Shun Li, Byung Rae Jin, Yeon Ho Je Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control // Journal of Microbiology and Biotechnology. — 2007-04. — В. 4. — Vol. 17. — С. 547–559. — ISSN 1017-7825.
  15. ↑ Jerry Adler The Growing Menace from Superweeds (англ.) // Scientific American. — 2011-05. — В. 5. — Vol. 304. — С. 74–79. — ISSN 0036-8733. — DOI:10.1038/scientificamerican0511-74
  16. ↑ 5. THE PROCESS OF GENETIC MODIFICATION. Проверено 3 декабря 2020.
  17. ↑ Desmond S. T. Nicholl An Introduction to Genetic Engineering. — Cambridge University Press, 2008-05-29. — 349 с. — ISBN 978-1-139-47178-7.
  18. ↑ Corinne A. Michels Genetic Techniques for Biological Research: A Case Study Approach. — John Wiley & Sons, 2002-06-10. — 264 с. — ISBN 978-0-471-89919-8.
  19. ↑ Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts Isolating, Cloning, and Sequencing DNA (англ.) // Molecular Biology of the Cell. 4th edition. — 2002.
  20. ↑ 20,0 20,1 Tae Kyung Kim, James H. Eberwine Mammalian cell transfection: the present and the future // Analytical and Bioanalytical Chemistry. — 2010-8. — В. 8. — Vol. 397. — С. 3173–3178. — ISSN 1618-2642. — DOI:10.1007/s00216-010-3821-6
  21. ↑ 21,0 21,1 Tulane University. Проверено 3 декабря 2020.
  22. ↑ R I Kaufman, B T Nixon Use of PCR to isolate genes encoding sigma54-dependent activators from diverse bacteria. // Journal of Bacteriology. — 1996-07. — В. 13. — Vol. 178. — С. 3967–3970. — ISSN 0021-9193.
  23. ↑ Jing Liang, Yunzi Luo, Huimin Zhao Synthetic biology: putting synthesis into biology // Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. — 2011. — В. 1. — Vol. 3. — С. 7–20. — ISSN 1939-5094. — DOI:10.1002/wsbm.104
  24. ↑ GeneArt Gene Synthesis - US (англ.). Проверено 3 декабря 2020.
  25. ↑ Paul Berg, Janet E. Mertz Personal Reflections on the Origins and Emergence of Recombinant DNA Technology // Genetics. — 2010-1. — В. 1. — Vol. 184. — С. 9–17. — ISSN 0016-6731. — DOI:10.1534/genetics.109.112144
  26. ↑ Nouri Nayerossadat, Talebi Maedeh, Palizban Abas Ali Viral and nonviral delivery systems for gene delivery // Advanced Biomedical Research. — 2012-07-06. — Vol. 1. — ISSN 2277-9175. — DOI:10.4103/2277-9175.98152
  27. ↑ Inês Chen, David Dubnau DNA uptake during bacterial transformation (англ.) // Nature Reviews Microbiology. — 2004-03. — В. 3. — Vol. 2. — С. 241–249. — ISSN 1740-1534. — DOI:10.1038/nrmicro844
  28. ↑ National Research Council (US) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms. — National Academies Press (US), 2004.
  29. ↑ Kirk E. Francis, Steven Spiker Identification of Arabidopsis thaliana transformants without selection reveals a high occurrence of silenced T-DNA integrations (англ.) // The Plant Journal. — 2005. — В. 3. — Vol. 41. — С. 464–477. — ISSN 1365-313X. — DOI:10.1111/j.1365-313X.2004.02312.x
  30. ↑ J. Schell, M. Van Montagu The Ti-Plasmid of AgrobacteriumTumefaciens, A Natural Vector for the Introduction of NIF Genes in Plants? (англ.) / Alexander Hollaender, R. H. Burris, P. R. Day, R. W. F. Hardy, D. R. Helinski, M. R. Lamborg, L. Owens, R. C. Valentine // Genetic Engineering for Nitrogen Fixation. — Boston, MA: Springer US, 1977. — С. 159–179. — ISBN 978-1-4684-0880-5. — DOI:10.1007/978-1-4684-0880-5_12
  31. ↑ Kahlin Leuzinger, Matthew Dent, Jonathan Hurtado, Jake Stahnke, Huafang Lai Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins // Journal of Visualized Experiments : JoVE. — 2013-07-23. — В. 77. — ISSN 1940-087X. — DOI:10.3791/50521
  32. ↑ Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts Glossary (англ.) // Molecular Biology of the Cell. 4th edition. — 2002.
  33. ↑ Kenya Kamimura, Takeshi Suda, Guisheng Zhang, Dexi Liu Advances in Gene Delivery Systems // Pharmaceutical medicine. — 2011-10-01. — В. 5. — Vol. 25. — С. 293–306. — ISSN 1178-2595. — DOI:10.2165/11594020-000000000-00000
  34. ↑ Embryonic Stem Cell-Mediated Gene Transfer - transgenicanimals. Проверено 3 декабря 2020.
  35. ↑ M. Tuomela, I. Stanescu, K. Krohn Validation overview of bio-analytical methods (англ.) // Gene Therapy. — 2005-10. — В. 1. — Vol. 12. — С. S131–S138. — ISSN 1476-5462. — DOI:10.1038/sj.gt.3302627
  36. ↑ S. Narayanaswamy Plant Cell and Tissue Culture. — Tata McGraw-Hill Education, 1994. — 684 с. — ISBN 978-0-07-460277-5.
  37. ↑ Barbara Hohn, Avraham A Levy, Holger Puchta Elimination of selection markers from transgenic plants (англ.) // Current Opinion in Biotechnology. — 2001-04-01. — В. 2. — Vol. 12. — С. 139–143. — ISSN 0958-1669. — DOI:10.1016/S0958-1669(00)00188-9
  38. ↑ Jane K. Setlow Genetic Engineering: Principles and Methods. — Springer Science & Business Media, 2002-10-31. — 290 с. — ISBN 978-0-306-47280-0.
  39. ↑ SA Deepak, KR Kottapalli, R Rakwal, G Oros, KS Rangappa Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes // Current Genomics. — 2007-6. — В. 4. — Vol. 8. — С. 234–251. — ISSN 1389-2029.
  40. ↑ Harvey F. Lodish Molecular cell biology. — New York : W.H. Freeman, 2000. — 1196 с. — ISBN 978-0-7167-3136-8.
  41. ↑ Maurício Rocha-Martins, Gabriel R. Cavalheiro, Gabriel E. Matos-Rodrigues, Rodrigo a. P. Martins, Maurício Rocha-Martins From Gene Targeting to Genome Editing: Transgenic animals applications and beyond (англ.) // Anais da Academia Brasileira de Ciências. — 2015-08. — В. 2. — Vol. 87. — С. 1323–1348. — ISSN 0001-3765. — DOI:10.1590/0001-3765201520140710
  42. ↑ Dana Carroll Genome Engineering With Zinc-Finger Nucleases // Genetics. — 2011-8. — В. 4. — Vol. 188. — С. 773–782. — ISSN 0016-6731. — DOI:10.1534/genetics.111.131433
  43. ↑ Kevin M Esvelt, Harris H Wang Genome-scale engineering for systems and synthetic biology // Molecular Systems Biology. — 2013-01-22. — Vol. 9. — С. 641. — ISSN 1744-4292. — DOI:10.1038/msb.2012.66
  44. ↑ Aimee Malzahn, Levi Lowder, Yiping Qi Plant genome editing with TALEN and CRISPR // Cell & Bioscience. — 2017-04-24. — Vol. 7. — ISSN 2045-3701. — DOI:10.1186/s13578-017-0148-4
  45. ↑ George Silva, Laurent Poirot, Roman Galetto, Julianne Smith, Guillermo Montoya Meganucleases and Other Tools for Targeted Genome Engineering: Perspectives and Challenges for Gene Therapy // Current Gene Therapy. — 2011-2. — В. 1. — Vol. 11. — С. 11–27. — ISSN 1566-5232. — DOI:10.2174/156652311794520111
  46. ↑ George H. Silva, Marlene Belfort, Wolfgang Wende, Alfred Pingoud From Monomeric to Homodimeric Endonucleases and Back: Engineering Novel Specificity of LAGLIDADG Enzymes (англ.) // Journal of Molecular Biology. — 2006-08-25. — В. 4. — Vol. 361. — С. 744–754. — ISSN 0022-2836. — DOI:10.1016/j.jmb.2006.06.063
  47. ↑ Michelle Christian, Tomas Cermak, Erin L. Doyle, Clarice Schmidt, Feng Zhang Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases // Genetics. — 2010-10. — В. 2. — Vol. 186. — С. 757–761. — ISSN 0016-6731. — DOI:10.1534/genetics.110.120717
  48. ↑ Andrew V. Anzalone, Peyton B. Randolph, Jessie R. Davis, Alexander A. Sousa, Luke W. Koblan Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. — 2019-12. — В. 7785. — Vol. 576. — С. 149–157. — ISSN 0028-0836. — DOI:10.1038/s41586-019-1711-4
ATCG.jpg
Генетика

История • Список генетических терминов

↑
[+]
Ключевые понятия

Наследственность • Изменчивость • Ген • Генотип • Фенотип • Аллели • Мутация • Мутагены • Хромосома • ДНК • Нуклеотид • РНК • Генетический код • Геном • Геном человека • Генетическая устойчивость

Области генетики

Молекулярная генетика • Цитогенетика • Популяционная генетика • Экологическая генетика • Эпигенетика • Генетика человека • Медицинская генетика • Геногеография • Археогенетика • Функциональная генетика

Закономерности

Наследование • Законы Менделя • Хромосомная теория наследственности • Взаимодействие генов • Сцепленное наследование • Сцепление с полом • Мутагенез

Связанные темы

Геномика • Генетическое разнообразие • Молекулярная эволюция • Генофонд • Филогенетика • Генетическая инженерия • Генетическая карта • Генетическая генеалогия • Генеалогический ДНК-тест • Гаплогруппы • Y-хромосомный Адам • Митохондриальная Ева • Методы генетической инженерии

Источник — http://cyclowiki.org/w/index.php?title=Методы_генетической_инженерии&oldid=1452969